核磁共振波譜法 （確定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法）
次瀏覽 | 更新時間：2023-05-25 20:31
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核磁共振波譜法
確定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法
利用核磁共振波譜進行分析的方法，叫做核磁共振波譜法（NMR）。
基本信息
| 外文名 | Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy |
| 功能 | |
| 特點 | 分辨率高 |
| 領(lǐng)域 | 結(jié)構(gòu)生物學(xué) |
核磁共振波譜的必要條件
產(chǎn)生核磁共振波譜的必要條件有三條：
1·原子核必須具有核磁性質(zhì)，即必須是磁性核 (或稱自旋核)，有些原子核不具有核磁性質(zhì)，它就不能產(chǎn)生核磁共振波譜。這說明核磁共振的限制性；
2·需要有外加磁場，磁性核在外磁場作用下發(fā)生核自旋能級的分裂，產(chǎn)生不同能量的核自旋能級，才能吸收能量發(fā)生能級的躍遷。
3·只有那些能量與核自旋能級能量差相同的電磁輻射才能被共振吸收，這就是核磁共振波譜的選擇性。由于核磁能級的能量差很小，所以共振吸收的電磁輻射波長較長，處于射頻輻射光區(qū)。
核磁共振波譜分析法(NMR)是分析分子內(nèi)各官能團如何連接的確切結(jié)構(gòu)的強有力的工具。磁場中所處的不同能量狀態(tài)（磁能級）。原子核由質(zhì)子、中子組成，它們也具有自旋現(xiàn)象。描述核自旋運動特性的是核自旋量子數(shù)I。不同的核在一個外加的高場強的靜磁場（現(xiàn)代NMR儀器由充電的螺旋超導(dǎo)體產(chǎn)生）中將分裂成2I+1個核自旋能級（核磁能級），其能量間隔為ΔE。對于指定的核素再施加一頻率為ν的屬于射頻區(qū)的無線電短波，其輻射能量hν恰好與該核的磁能級間隔ΔE相等時，核體系將吸收輻射而產(chǎn)生能級躍遷，這就是核磁共振現(xiàn)象。
核磁共振頻譜（英：Nuclear magnetic resonance spectroscopy，簡稱NMR spectroscopy），又稱核磁共振波譜，是將核磁共振現(xiàn)象應(yīng)用于測定分子結(jié)構(gòu)的一種譜學(xué)技術(shù)。目前，核磁共振波譜的研究主要集中在H（氫譜）和C（碳譜）兩類原子核的波譜。
人們可以從核磁共振波譜上獲取很多信息，正如同紅外光譜一樣，核磁共振波譜也可以提供分子中化學(xué)官能團的數(shù)目和種類，但除此之外，它還可以提供許多紅外光譜無法提供的信息。核磁共振波譜對自然科學(xué)研究有著深遠的影響，人們不僅可以借助它來研究反應(yīng)機理，還可以用來研究蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)與功能。供研究的核磁樣品可為液體或固體。
概述
磁性原子核，比如H和C在恒定磁場中，只和特定頻率的射頻場作用。共振頻率，原子核吸收的能量以及信號強度與磁場強度成正比。比方說，在場強為21特斯拉的磁場中，質(zhì)子的共振頻率為900MHz。盡管其他磁性核在此場強下?lián)碛胁煌墓舱耦l率，但人們通常把21特斯拉和900MHz頻率進行直接對應(yīng)。
化學(xué)位移
在一個分子中，各個質(zhì)子的化學(xué)環(huán)境有所不同，或多或少地受到周邊原子或原子團的屏蔽效應(yīng)的影響，因此它們的共振頻率也不同，從而導(dǎo)致在核磁共振波譜上，各個質(zhì)子的吸收峰出現(xiàn)在不同的位置上。但這種差異并不大，難以精確測量其絕對值，因此人們將化學(xué)位移設(shè)成一個無量綱的相對值，即：某一物質(zhì)吸收峰的頻
透過不同質(zhì)子的化學(xué)位移，人們可以得出這些質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境，從而得出該分子的結(jié)構(gòu)信息，這種過程稱之為“解譜”。比如對于乙醇分子，具有三種不同化學(xué)環(huán)境的質(zhì)子，即：甲基、亞甲基和羥基。在其H譜圖上，可以看到3個特有的峰信號各自處于特定的化學(xué)位移，其中位于1 ppm的峰信號對應(yīng)甲基，位于4 ppm的信號對應(yīng)亞甲基，位于2~3 ppm之間的信號對應(yīng)羥基，其具體化學(xué)位移值和采用的NMR溶劑有關(guān)。另外，從峰信號的強度可以得出相對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)量，比如乙醇分子中的甲基擁有3個質(zhì)子，亞甲基擁有2個質(zhì)子，在譜圖上，對應(yīng)的甲基和亞甲基峰強度比為3：2。
現(xiàn)代的分析軟件可以協(xié)助人們通過分析峰信號，從而得出究竟有幾個質(zhì)子形成了此信號。這種方法稱作“積分”，即通過計算面積（不單單是高度，還有峰寬度）來得出相關(guān)質(zhì)子數(shù)目。但必須指出的是，這種計算方法僅適用于最簡單的一維譜，對于更復(fù)雜的譜圖，比如C譜，其積分還與原子核的弛豫速率和偶極耦合常數(shù)相關(guān)，而這些常常被人誤解。因此，用積分法來解析復(fù)雜核磁譜圖是相當(dāng)困難的。
耦合
峰的裂分 | 強度比 |
單重 | 1 |
雙重 | 1:1 |
三重 | 1:2:1 |
四重 | 1:3:3:1 |
五重 | 1:4:6:4:1 |
展開表格
在一維譜圖上，除峰信號數(shù)量，峰信號強度之外，還有一個有助于解析分子結(jié)構(gòu)的信息，即磁性原子核之間的J-耦合。這種耦合來源于臨近磁性原子核的不同自旋狀態(tài)數(shù)的相互作用，這種相互作用會改變原子核自旋在外磁場中進動的能級分布狀況，造成能級的裂分，進而造成NMR譜圖中的信號峰形狀發(fā)生劈裂，信號峰的劈裂狀態(tài)可以得出分子內(nèi)各原子和官能團之間的連接方式，以及臨近的磁性核數(shù)目。
兩個相鄰的氫核之間的耦合遵循一定的規(guī)則，n個氫核將把相鄰磁性核信號峰劈裂成n+1個多重峰，并且這n+1個多重峰之間的強度關(guān)系依照楊輝三角形規(guī)則。例如，乙醇分子中的甲基峰與相鄰的亞甲基耦合，呈三重峰狀，三重峰之間的強度比為1：2：1。不過如果一個氫核同時與兩個不同性質(zhì)的氫核進行耦合，則不會得到三重峰，而是得到雙雙重峰（dd）。要注意的是，如果兩個磁性核之間相隔3個化學(xué)鍵以上，耦合就變得十分微弱，以至于不會出現(xiàn)峰的劈裂，但在芳烴和脂環(huán)類化合物中三鍵距離以上的長程耦合通?？梢缘玫捷^復(fù)雜的劈裂峰。
二級耦合
上文提到的內(nèi)容是在耦合常數(shù)和化學(xué)位移間隔相比很小的情況下描述的，如果耦合常數(shù)較高，或化學(xué)位移間隔小，那么多重峰的情況將變得復(fù)雜，特別是兩個以上的磁性核進行耦合時，這可以通過增強多重峰當(dāng)中的特定幾個峰，并以犧牲其他峰的代價進行解決，不過在高場譜（比如高頻譜）當(dāng)中，這種現(xiàn)象并不明顯，因此提高核磁儀器的頻率可以避免此問題。
磁不等價
相關(guān)譜
主條目：關(guān)聯(lián)性磁振頻譜 相關(guān)譜（Correlation Spectroscopy）是二維核磁波譜的一種，常常簡寫為COSY。其它二維譜還包括J頻譜（J-spectroscopy），交換頻譜（EXSY，Exchange spectroscopy），核歐佛豪瑟效應(yīng)頻譜（NOESY，Nuclear Overhauser effect spectroscopy），全相關(guān)譜（TOCSY，total correlation spectroscopy），近程碳氫相關(guān)（HSQC，Heteronuclear single quantum coherence），遠程碳氫相關(guān)（HMBC，Heteronuclear multiple bond coherence）等。二維譜在解析分子結(jié)構(gòu)方面可比一維譜提供更多的信息，特別是用一維譜解析復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)遇到困難的時候，二維譜可以提供幫助。歷史上首次二維譜實驗方法由比利時布魯塞爾自由大學(xué)（Université Libre de Bruxelles）教授讓·吉納（Jean Jeener）于1971年提出，之后其實驗操作由沃爾特·歐（Walter P. Aue），恩里克·巴爾托爾蒂（Enrico Bartholdi）和理查德·恩斯特（Richard R. Ernst）完成，并于1976年發(fā)表。
固體核磁波譜
液體核磁樣品如果放在某些特定的物理環(huán)境下，是無法進行研究的，而其它原子級別的光譜技術(shù)對此也無能為力。但在固體中，像晶體，微晶粉末，膠質(zhì)這樣的，偶極耦合和化學(xué)位移的磁各向異性將在核自旋系統(tǒng)占據(jù)主導(dǎo)，在這種情況下如果使用傳統(tǒng)的液態(tài)核磁技術(shù)，譜圖上的峰將大大增寬，不利于研究。
目前已經(jīng)有一系列的高分辨率固體核磁技術(shù)被研發(fā)出來。高分辨固體核磁技術(shù)包含兩個重要概念，即通過高速旋轉(zhuǎn)來限制分子自取向和消除磁各向異性，對于后者，最常用的旋轉(zhuǎn)方式是魔角旋轉(zhuǎn)（Magic angle spinning），即旋轉(zhuǎn)軸和主磁場的夾角為54.7°。
固體核磁技術(shù)常被用于膜蛋白，蛋白纖維和聚合物的結(jié)構(gòu)探究，以及無機化學(xué)中的化學(xué)分析。但同樣可被應(yīng)用于研究于樹葉和燃油。
核磁譜在蛋白質(zhì)研究上的應(yīng)用
利用核磁譜研究蛋白質(zhì)，已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的一項重要技術(shù)手段。X射線單晶衍射和核磁都可獲得高分辨率的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，不過核磁常局限于35kDa以下的小分子蛋白，盡管隨著技術(shù)的進步，稍大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也可以被核磁解析出來。另外，獲得本質(zhì)上非結(jié)構(gòu)化（Intrinsically Unstructured）的蛋白質(zhì)的高分辨率信息，通常只有核磁能夠做到。
蛋白質(zhì)分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，一維核磁譜常顯得重疊擁擠而無法進行解析，使用二維，三維甚至四維核磁譜，并采用13C和15N標(biāo)記可以簡化解析過程。另外，NOESY是最重要的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法之一，人們通過NOESY獲得蛋白質(zhì)分子內(nèi)官能團間距，之后通過電腦模擬得到分子的三維結(jié)構(gòu)。
核磁共振波譜法
暫無
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