Johan Winnubst：“工欲善其事必先利其器”——皮層神經(jīng)元組成圖譜建立的工具

大腦是由復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)所組成，這些具有不同特性的細(xì)胞之間互相連接，促進(jìn)了大腦以及機(jī)體精密活動(dòng)的完成。如何將特性相似的神經(jīng)元進(jìn)行分類以及神經(jīng)元多樣性的全景究竟是怎樣的仍是目前神經(jīng)生物學(xué)的重要課題。但是，想要解決這一問題并非易事。為此，科學(xué)家們組建了大腦神經(jīng)元細(xì)胞普查網(wǎng)絡(luò)聯(lián)盟BICCN，并且建立了大腦皮層初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元圖譜。該圖譜中囊括了小鼠、非人靈長類動(dòng)物以及人類大腦中神經(jīng)元的分子、功能以及與其物理狀態(tài)相關(guān)的數(shù)據(jù)（圖1）。

圖1 大腦皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元圖譜

單細(xì)胞RNA測序技術(shù)scRNA-seq是一種用于測量單個(gè)細(xì)胞中基因表達(dá)的技術(shù)，可以通過一次生成數(shù)千個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜來表征神經(jīng)元的多樣性。BICCN聯(lián)盟中一個(gè)關(guān)鍵策略是通過高分辨率的scRNA-seq技術(shù)應(yīng)用于大腦皮層之中進(jìn)行神經(jīng)元多樣性的分析。比如在此次BICCN聯(lián)合發(fā)表的文章中采用的MERFISH技術(shù)可以用來標(biāo)記小鼠腦組織中的基因，從而確定這些不同的細(xì)胞類型在初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層中的空間位置。另外，BICCN聯(lián)盟中還建立了Patch-seq，可以對(duì)神經(jīng)元的電特性進(jìn)行記錄，隨后可以對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析，并與其三維形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)重建相結(jié)合。除此之外，BICCN還對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的表觀遺傳修飾進(jìn)行分析，同時(shí)將這些細(xì)胞的類群根據(jù)表觀遺傳特征進(jìn)行投射，從而可以對(duì)不同細(xì)胞群進(jìn)行分析。 另外，哺乳動(dòng)物大腦在發(fā)育和進(jìn)化過程中神經(jīng)元多樣性的起源是什么呢？為了解決這一問題，BICCN所發(fā)表的文章通過研究了跨物種的神經(jīng)元類型表觀遺傳修飾，表觀遺傳修飾是由基因表達(dá)的模式所定義的。研究者通過將基因表達(dá)數(shù)據(jù)與單個(gè)細(xì)胞DNA上甲基化的豐度以及染色質(zhì)的DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物中的DNA可及性進(jìn)行組合，對(duì)不同神經(jīng)元中基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的程序進(jìn)行解析。另外，BICCN聯(lián)盟中的研究確認(rèn)了不同細(xì)胞類型基因組的潛在調(diào)控區(qū)域。這些細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄因子富集位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)具有跨物種的高度保守性，可用于生成進(jìn)一步研究不同神經(jīng)元多樣性的遺傳工具，因此BICCN中的工作可以標(biāo)記廣泛的轉(zhuǎn)錄亞類型特征。 除此之外，BICCN聯(lián)盟中的工作強(qiáng)調(diào)，想要對(duì)大腦的細(xì)胞多樣性進(jìn)行更深層的理解，需要引入新的概念并建立新的數(shù)學(xué)框架模型。比如，如何建立新的數(shù)學(xué)模型描述不同細(xì)胞亞型之間細(xì)微差異以及空間位置相關(guān)的連續(xù)梯度。 盡管BICCN聯(lián)盟中的許多技術(shù)已有應(yīng)用，但是這些技術(shù)首次被應(yīng)用在這樣一個(gè)高度協(xié)作、高通量的數(shù)據(jù)庫與圖譜的建立之中，提供了前所未有的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元多樣性景觀。此外，該聯(lián)盟將數(shù)據(jù)庫向大眾開放（https://biccn.org），并構(gòu)建了可以直接應(yīng)用的軟件，從而確保這些數(shù)據(jù)能夠?qū)ι窠?jīng)元多樣性的性質(zhì)和起源的研究大有裨益，真正做到數(shù)據(jù)庫落到科研的實(shí)際使用之中。

Silvia Arber：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元多樣性的“人口普查”——未來研究的福音

大腦中細(xì)胞類型的高度多樣性和復(fù)雜性給神經(jīng)科學(xué)界帶來了巨大的挑戰(zhàn)。通過構(gòu)建這樣一個(gè)龐大的數(shù)據(jù)庫圖譜，BICCN聯(lián)盟對(duì)于皮層神經(jīng)元細(xì)胞類型的定義以及細(xì)胞如何建立在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)上的連接提供新的、更為全面的參考。之所以選擇運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元皮層，原因有三：其一，該區(qū)域的神經(jīng)元投射延伸到運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的許多其他的部分，但是該區(qū)域與其他區(qū)域之間是如何進(jìn)行相互作用的還不得而知，是仍然大有可為的“黑匣子”領(lǐng)域；其二，運(yùn)動(dòng)皮層控制機(jī)體的運(yùn)動(dòng)，因此了解不同的神經(jīng)元細(xì)胞類型與功能進(jìn)行直接聯(lián)系；其三，從進(jìn)化的角度上來說，該區(qū)域的大小、細(xì)胞類型的多樣性以及功能在不同物種之中存在較大的差異，因此可以對(duì)運(yùn)動(dòng)皮層的神經(jīng)元多樣性的進(jìn)化過程進(jìn)行探究。 由此，神經(jīng)科學(xué)家將可以訪問包含不同物種運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中不同類型細(xì)胞的許多方面信息的數(shù)據(jù)庫，其中包括細(xì)胞基因表達(dá)、表觀遺傳修飾、細(xì)胞形態(tài)以及電生理特征等。

同時(shí)，BICCN聯(lián)盟還構(gòu)建了多種小鼠品系，可以通過遺傳操作標(biāo)記特定的神經(jīng)元群體或者是控制部特定運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活動(dòng)。這些工具的研發(fā)將有助于揭開這些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與其對(duì)應(yīng)的功能之間的聯(lián)系。 關(guān)于皮層神經(jīng)元的相互作用方式的主流認(rèn)知主要存在兩類，一類是皮層神經(jīng)元只與皮層神經(jīng)元進(jìn)行交流，另一類認(rèn)為皮層神經(jīng)元也與其他神經(jīng)元之間存在交流。BICCN聯(lián)盟中的工作可以對(duì)皮層神經(jīng)元在大腦神經(jīng)環(huán)路中之間的相互作用進(jìn)行研究，從而可以確定這些神經(jīng)元是如何促進(jìn)運(yùn)動(dòng)的學(xué)習(xí)、控制以及執(zhí)行以及這些動(dòng)作如何在神經(jīng)系統(tǒng)層面進(jìn)行展開的。 BICCN聯(lián)盟的工作所進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的“人口普查”，給了這些神經(jīng)元一個(gè)明確的身份，并涵蓋了皮層神經(jīng)元的發(fā)展歷史，包括這些神經(jīng)元的成熟的發(fā)展軌跡、可塑性以及動(dòng)態(tài)變化。在機(jī)體發(fā)育過程中所運(yùn)行的遺傳程序?qū)τ诖_定神經(jīng)元細(xì)胞類型的基本屬性至關(guān)重要，比如包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放或者放電特性等基本功能屬性。BICCN聯(lián)盟中的工作可以提高研究人員在小鼠中靶向標(biāo)記不同細(xì)胞類型的能力。

除此之外，BICCN中的研究也包含對(duì)不同物種中細(xì)胞類型的比較。這些方法有助于了解關(guān)鍵神經(jīng)元細(xì)胞類型是從什么細(xì)胞進(jìn)化而來的、哪些細(xì)胞類型是進(jìn)化上出現(xiàn)的對(duì)大腦皮層精細(xì)活動(dòng)能力的“錦上添花”附加細(xì)胞以及促進(jìn)進(jìn)化上新功能出現(xiàn)的分子機(jī)制。 BICCN中的工作是指向未來的真正寶藏。該數(shù)據(jù)庫對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)環(huán)路是如何進(jìn)行的提供了研究數(shù)據(jù)庫和操作平臺(tái)，同時(shí)這些工作對(duì)于制定特定細(xì)胞類型的大腦疾病治療方案至關(guān)重要，最終將幫助臨床醫(yī)療手段的研究和藥物的開發(fā)，真正達(dá)到“指哪兒打哪兒”、“藥到病除”的個(gè)性化醫(yī)療目的?；叵?50年前，神經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大腦皮層中的某一區(qū)域進(jìn)行電刺激便可以誘發(fā)運(yùn)動(dòng)行為，從那時(shí)起，神經(jīng)科學(xué)就翻開了嶄新的一頁。

以下為16篇Nature簡況（詳細(xì)解讀見后期相關(guān)內(nèi)容）

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第一篇Nature來自于BRAIN Initiative Cell Census Netword（BICCN），題目為A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex。該文章提綱挈領(lǐng)地介紹了BICCN的工作，即繪制了哺乳動(dòng)物初始運(yùn)動(dòng)皮層多層次、多模式的細(xì)胞圖譜。該工作包括了：1）利用轉(zhuǎn)錄組、染色質(zhì)可及性組、甲基化組多組學(xué)描繪了運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞中的分子遺傳景觀；2）跨物種分析揭示從小鼠到狨猴到人的細(xì)胞類型保守性；3）原位單細(xì)胞組學(xué)揭示運(yùn)動(dòng)皮層空間圖譜；4）交叉模式分析揭示神經(jīng)元的生理與解剖特性和基因組基礎(chǔ)?？傊珺ICCN這一工作構(gòu)建了神經(jīng)元的類型框架，結(jié)合了分子信息、空間信息以及表型信息等多維度信息。

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第二篇的通訊作者為Eran A. Mukamel和Hongkui Zeng，題目為A transcriptomic and epigenomic cell atlas of the mouse primary motor cortex。在該項(xiàng)工作中，作者們構(gòu)建了小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層中超過50萬個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和甲基化組，刻畫出了超過56種神經(jīng)元類型。

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第三篇來自于Ed S. Lein和Trygve E. Bakken，題目為Comparative cellular analysis of motor cortex in human, marmoset and mouse。該工作對(duì)小鼠、狨猴以及人類初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層中共計(jì)超過45萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和表觀組測序，揭示了不同物種中初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層中神經(jīng)元類型之間的保守性，以及各物種之間的獨(dú)特性。

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第四篇來自于Ed Lein，題目為Human neocortical expansion involves glutamatergic neuron diversification。該研究利用膜片鉗技術(shù)、biocytin染色和單細(xì)胞測序構(gòu)成的平臺(tái)Patch-Seq檢測了人的新皮層，展示了五種谷氨酸能神經(jīng)元在形態(tài)、生理、基因表達(dá)上的吻合性，揭示了皮層中神經(jīng)元種類的豐富性。

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第五篇來自于Joseph R. Ecker，題目為DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution。該工作對(duì)小鼠皮層、海馬、紋狀體、蒼白球、嗅覺區(qū)上45個(gè)區(qū)域共計(jì)103,982個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了DNA甲基化測序，構(gòu)建了不同腦區(qū)神經(jīng)元甲基化圖譜與網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)將甲基化組與染色質(zhì)可及性組數(shù)據(jù)結(jié)合，描繪了小鼠大腦神經(jīng)元多樣性與空間組織的表觀基礎(chǔ)。

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第六篇來自于任兵，題目為An atlas of gene regulatory elements in adult mouse cerebrum。該工作研究了成年小鼠同形皮層、嗅球、海馬以及腦核區(qū)45個(gè)區(qū)域共計(jì)超過80萬個(gè)細(xì)胞的染色質(zhì)可及性，構(gòu)建出了超過160個(gè)不同細(xì)胞類型的順式作用元件調(diào)控圖譜。

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第七篇來自于莊小威，題目為Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH。該工作利用MERFISH（single-cell transcriptome-imaging method, multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization），剖析了小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層以及鄰近區(qū)域共計(jì)約30萬個(gè)細(xì)胞，確定了95個(gè)神經(jīng)元/非神經(jīng)元細(xì)胞群，描繪了初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層復(fù)雜的空間網(wǎng)絡(luò)。

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第八篇來自于Hong-Wei Dong，Julie Harris，Pavel Osten， Z. Josh Huang和Giorgio Ascoli，題目為Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex。該工作利用基因標(biāo)記、測序、全腦成像等技術(shù)，構(gòu)建了小鼠primary motor cortex, upper limb area (MOp-ul)的3D結(jié)構(gòu)圖譜，在該區(qū)域定義了24個(gè)投射神經(jīng)元類型，并繪制了輸入-輸出神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。

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第九篇來自于Hong-Wei Dong，題目為The mouse cortico–basal ganglia–thalamic network。該工作鑒定了六個(gè)并行的皮質(zhì)-基底核-丘腦網(wǎng)絡(luò)。

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第十篇來自于Edward Callaway和Joseph Ecker，題目為Epigenomic diversity of cortical projection neurons in the mouse brain。該工作利用逆行標(biāo)記和單個(gè)核DNA甲基化測序，檢測了63個(gè)皮質(zhì)-皮層、皮質(zhì)-亞皮層遠(yuǎn)距離投射的11827個(gè)新皮層神經(jīng)元，將分子特征與神經(jīng)元的解剖和投射特性聯(lián)系了起來。

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第十一篇來自于Hongkui Zeng和Hanchuan Peng，題目為Morphological diversity of single neurons in molecularly defined cell types。該工作重構(gòu)了皮層、屏狀核、丘腦和紋狀體上1741個(gè)神經(jīng)元，鑒定了不同形狀特征和基因表達(dá)特征的11種投射神經(jīng)元類型，揭示了其細(xì)胞多樣性。

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第十二篇來自于Z. Josh Huang，題目為Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex。該工作通過構(gòu)建多種可瞬時(shí)誘導(dǎo)的Cre Flp敲入小鼠，詳細(xì)解析了錐體神經(jīng)元不同亞群的命運(yùn)圖譜，揭示了錐體神經(jīng)元的層級(jí)分化軌跡。

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第十三篇來自于Lior Pachter，題目為Isoform cell-type specificity in the mouse primary motor cortex。該研究對(duì)小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層中6,160個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了SMART-Seq，280,327個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了MERFISH，94,162個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了10x Genomic單細(xì)胞測序，揭示了不同細(xì)胞類型中的同源異構(gòu)體（isoform），以及其轉(zhuǎn)變，揭示了同源異構(gòu)體在鑒定細(xì)胞類型中的功能。

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第十四篇來自于Arnold R. Kriegstein，題目為An atlas of cortical arealization identifies dynamic molecular signatures。該研究利用單細(xì)胞測序研究了神經(jīng)發(fā)育和早期膠質(zhì)生成階段10個(gè)主要的腦區(qū)和6個(gè)新皮層區(qū)域，揭示了不同皮層區(qū)域不同細(xì)胞縱向發(fā)育的分子圖譜。

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第十五篇來自于Tomasz J. Nowakowski，題目為Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development。該工作利用單細(xì)胞ATAC-seq，分析了人皮層發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型的基因位點(diǎn)和調(diào)控元件圖譜，揭示了大腦皮層神經(jīng)元祖細(xì)胞的多樣性。

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第十六篇來自于Evan Macosko，題目為A transcriptomic atlas of mouse cerebellar cortex comprehensively defines cell types。該研究利用高通量測序研究了小鼠小腦不同葉區(qū)不同細(xì)胞類型的分子圖譜，揭示了不同細(xì)胞類型獨(dú)特的分子特征，并將此特征與生理特征進(jìn)行了聯(lián)系。